Вирусологични изследвания. Чревни заболявания. (Част 3)

Всичко от първите серии са на базата на "сандвич" принцип по-късно се използва за "тандем" -version. В процеса на изграждане комплекти направени различни подобрения както на изложението на EIA, и обработка на пробата, и се прилагат буферни системи. Например, някои автори препоръчват използването на EDTA за отстраняване на външния капсид обвивка, която разкрива капсида на група антигени вътрешния. Други предложени проби обработка Eagle MEM с 0.5% лакталбуминов хидролизат и антибиотици позволява използването на този екстракт за откриване на вируса в тъканната култура и ТЕМ, което прави възможно да се използва една и съща проба в различните методи на изследването. Много важно буфер за междинно изплакване. Повечето от тези буфери съдържа физиологичен разтвор с ниска концентрация на детергент, Tween 20 (Bryden A. S., 1990). Всички комплекти са положителни и отрицателни контроли. Като отрицателна контрола може да се използва като буфери и специален отрицателен серум. Като положителни контроли тествани положителни серуми използва. Въпреки това следва да се отбележи, че тълкуването на резултатите варира при всеки опит. Основната мярка за комплект е минимум реактивен или "прекъсване", която обикновено се използва за определяне на положителен резултат и разлика ниво между отрицателната контрола и положително ниво, което в идеалния случай, оптичната плътност (OD) на отрицателен контрол трябва да бъде <0,1. Однако на практике этот показатель колеблется у различных тестов. Что касается положительного результата, то он может быть достоверен в подавляющем большинстве случаев при показателях ОД > 0,5, т. е. в несколько раз превышает ОД негативного контроля. В то же время небольшая часть образцов слабо реагирует с ОД между «cut-off» и 0,5. Многие из них могут быть отрицательны в ПЭМ, но большая часть — положительна при ЭФ в ПААГ, ПЦР. Эти моменты необходимо принимать во внимание при проведении и учете ИФА.

Поради големия брой на пазара системи за изпитване, имаше цяла поредица от творби, посветени на определяне на относителната им ефективност.

Трябва да се отбележи, че първите търговски тест-системи са далеч от перфектни показатели чувствителност и специфичност. Така че, Gibchrist М. и др. (1987) на материала от 136 пациенти бяха определени следните стойности за 4 ELISA тест-системи: ротавирус EIA, Указател, ротавирус Bioenzabead и Rotenzyme II, равни на 91%, 98%, 80%, 84% и 100%, 78%, 95 %, 88 / с, съответно. Разкрити ниската спецификата на системите за изпитване и Pathfinder Rotazyme II, последният даде фалшиво положителни резултати, а според други автори.

За подобряване на спецификата на системите за изпитване, учените започват да използват моноклонални антитела. поликлонално на тестове и моноклонални антитела са показани в полза на последната. Група автори определят ефикасността на два показателя диагностични тестови системи, базирани на моноклонални антитела (Rotaclone, Pathfinder) и системи на базата на трите поликлонални антитела (Rotavirus EIA, Rotazyme II, Wellcozyme ротавирус Денехи P. и сътр., 1998). В изследването на проби от изпражнения от 100 пациенти с тествани в страницата EF гастроентерит, беше показано, че двете тестови системи, базирани на моноклонални антитела се различават максимална (100%) чувствителност. Чувствителността на системите за поликлонални изпитване повече от 90% с колебания на специфичност в диапазона от 55 до 100% (Денехи R. и др., 1988).

Flewett Т. и сътр. (1989) на материали от 1163 деца (в т. Н. 66 кърмачета) в сравнение диагностичната ефикасността на системата за изпитване Dakopatts посредници и на стандарта на СЗО тест системи. Чувствителност и специфичност са Dakopatts равни на 97% в сравнение с тест системата на СЗО. Освен това в изследването на материали от тези фигури изпитване новородени тестови системи са съответно 100% и 98%.

Сравнителна оценка на други тестови системи ELISA: Rotascreen, Wellcozyme, Rotazyme II и Идея показа, че само Rotascreen и Идея има специфичност и чувствителност по-голяма от 90% (Molyneaux R. J. и сътр ,. 1989).

Във връзка с данните за спецификата на ELISA закъснение от опитите си за подобряване на чувствителността на метода са направени, че са се подобрили тези параметри. Сравнително изследване на чувствителността, специфичността и съвпадение на положителни и отрицателни резултати от търговски комплекти VIDAS ротавирус Rotaclone Указател и под контрола на РЕМ в проучването на 464 kopromaterialov показа отлични резултати: VIDAS Ротавирусните 98- 99,3, 98,7 и 99% - Rotaclone - 100 - 98 99- и 100- Pathfinder - 100- 92,4- 87,3 и 100% (Денехи R. Н. и др, 1994). Както се вижда от горните данни, търговски тестове качествени параметри са станали толкова големи, че броят на изследователите (както ни се струва малко прибързано) предложи да се използва като референтен стандарт ELISA комплект Rotaclone, Кеймбридж Biosci. Corp. (Денехи P. Н. и др., 1990). Въпреки това, не по-предпазливо оглед на авторите, за абсолютно точни данни, заедно с IFA и се използват други методи за изследване. ТЕМ, PCR, EF PAGE (Donneli G. и др, 1993 Husain М. и др, 1995- Markowsca-. Daniel J. и сътр., 1996- Buesa G. и др., 1996- Денехи РН и сътр., 1994 Jiang Б. и др., 1995). Въпреки напредъка в развитието на системите за изпитване ELISA, за да ги подобри Провеждат се изследвания. Така че, Ribas-Антунез М. и др. (1998) провежда сравнителна оценка на ELISA място и EF PAGE в проучването на 100 kopromaterialov проби. Авторите на висока чувствителност, специфичност и съгласието на резултатите от тези методи е доказано.

Заедно с приложението на търговски тестови системи за успешни опити за разработване на лабораторни ELISA комплекти са направени от няколко автори (Ruggeri Е. и сътр., 1992- Husain М. и др., 1995- Buesa J. и сътр., 1996). Copyright лабораторни тестове на основните параметри не се мерят с тези на пазара системи за изпитване. По този начин, на снимачната площадка е проектирана от Индийския национален институт по вирусология (Pune) за диагностика на ротавирусна инфекция (NIV), което се сравнява с търговски набор Dakopatts (Kelkar S. D., 1993). В процеса на проверка 63 паралелни проби се появяват че NIV разкри 36 заразените лица (57%), Dakopatts - 33 (52%) в 100% специфичност. Въпреки това, цената на лаборатория на наркотици е значително по-ниска в сравнение с други китове, които позволиха на авторите да предполагат използването на NIV в развиващите се страни.

В нашата страна също започна производство на вътрешни тестове търговски за IFA: "Rotapast" (Санкт Петербург), "на Rota антиген" (Нижни Новгород), "Рот-анализ" (Екатеринбург). Чувствителността и специфичността на тези комплекти, за съжаление, дава подобни резултати и чужди агенти е 75%, с съвпадението на положителни резултати - 90%, отрицателните резултати - 86% (Karpovitch A. G. и сътр., 1991). В същото време в няколко лаборатории, разработени и тествани собствените тестови системи ELISA за диагностика на ротавирус: Bukrin AG, Василиев 1988 BJ сътр, 1989 Ramishvili Lee L. и др., 1991. - Dzyublik IV и др, 1990 Nosatenko AI и др, 1991) ...

По този начин, висока чувствителност и специфичност, бързина и способност за научни изследвания резултати счетоводство автоматично предоставяне на приоритет ELISA наред с други лабораторни методи за диагностика ротавирус. Трябва да се отбележи, че IFA се използва не само за откриване на антигена, но също така и за записване на вируса на откривания. Такава широка гама от възможности на метода го прави незаменим в някоя лаборатория.

Седиментните всички диагностични тестове включват реакция на базата на частиците на аглутиниране (еритроцити, латекс, бактерии) сенсибилизирани с антигени или антитела, които са способни да агрегират в присъствието на серум или хомоложни антигени. Частиците служат като носители на специфични детерминанти, агрегиране, което се появява в резултат на антиген-антитяло реакция, която е визуално записани от присъствието и природата на утайка, образувана. Следователно, прилагането на тест утайка може да се открие като антигени и антитела.

Реакцията на хемаглутинацията (RHA) се основава на способността на човешките червени кръвни клетки, различни видове животни и птици аглутинират човешки ротавирус и животни. Тази реакция се използва в началните етапи на изследване и диагностика на ротавирусна инфекция (Drozdov., И др., 1982). По-скорошни изследвания са показали, че не всички щамове на ротавирус могат да аглутинира еритроцити (Ezeqiel М. и др., 1995). В тази връзка, диагностичната стойност на този метод е под въпрос и в момента е RGA е почти никога не се използва. В същото време, има съобщения за използването на хемаглутинационна реакция в проучвателно характер на изследването относно определяне на способността на човешки и животински ротавируси аглутинира еритроцити на различните групи, както и за изследване на условията, при които е налице хемаглутинацията (Devitt SM, 1993). Последните произведения, посветени на конкретен ген протеини, отговорни за хемаглутинацията и аминокиселинната последователност, кодираща тази способност. В резултат на това успя създаване хемаглутинацията домейн намира между 93 и 203 АА VP4 (Crawford S. и сътр., 1994 Ezeqiel М. и др., 1995).

Реакцията на непряко или пасивна хемаглутинация (РНА или RIGA) доста често се използва в лабораторна практика (особено в малка лаборатория), ако е необходимо, се проучат голям брой случаи и бързи резултати (Кравченко Т. М. и др., 1991 Zarubinsky Vy , капачка S. A., 1989 Zakirova С. Е. и сътр., 1990 Vasil'ev J. и сътр., 1987 г. Придобита 1989 Kirin VN и сътр., 1991 и A. W. Abenova и сътр., 1991).

За разлика от RSA, RIGA използва в еритроцити чувствителни ротавирусен антиген. Традиционно обект за сенсибилизация са човешки червени кръвни клетки, овце и домашни птици - кокошки, пуйки, патици. Получава се от еритроцитни препарати птици се утаяват по-бързо, което намалява анализ време без загуба на реакции на чувствителност. Процесът на свързване на антитела срещу еритроцити се извършва по различни реагенти, най-често от които са амидол и VDV (bidiazotirovanny бензидин). Освен това, използването на имуноглобулини в чувствителността на еритроцити повишава ефективността на диагностичната лекарството (Chubov N. В. и др., 1991). В нашите изследвания, РИГА извършва еритроцитите diagnosticum чрез техника, разработена в Свердловск Ниевес.

Определяне резултати от ротавирус в kopromaterialah показват, че RIGA чувствителност е 72% в сравнение с 86% в ELISA, и съвпадение на резултатите под контрола на ТЕМ и ЙОМ е 100% (Vasil'yev В. J. и сътр., 1989). RIGA сравняване на резултатите с ТЕМ и RSK VIEF намерено висока чувствителност RIGA (Tamendarova Н. С. и др., 1989). Подобни данни за материали и от 866 деца, получени прилагането RIGA, ТЕМ и ЙОМ (Zarubinsky VY, капачка S. A., 1989). Установено е, че чувствителността е еквивалентна RIGA ТЕМ и съвпадение между тези методи възлиза на 96,6%. Сравними резултати късно Abenova W. A., се получават и сътр. (1961). Изпитните 1458 kopromaterialov деца, хоспитализирани с RV инфекция от Рига DGC и TEM разкриха VIEF RV антиген 35,8- 26,2- 18,2 и 39,8% на проби, съответно. Следователно RIGA продължава да се прилага в лабораторна диагностика, но липсата на стабилни при съхранение търговски еритроцитни препарати затруднява широко се използва за откриване на ротавирусни антигени при пациенти на материали. Заедно с директен РНА в лабораторията по метода на обратната TPHA използва за определяне на RV в клетъчна култура и kopromaterialah и понастоящем (Tokieda М. и др., 1996- Kuzuya М. и др., 1998).