Вирусологични изследвания. Чревни заболявания. (Част 2)

Прилагане на ТЕМ метода разкрива висока специфичност, но неговата чувствителност е по-малък редица други лабораторни тестове. Проучване материали 207 от двама пациенти с ELISA комплекти диагностика и ТЕМ като референтен метод показват, че ТЕМ чувствителност е 80% при 100% специфичност, а чувствителността на ELISA на основата на моноклонални антитела е по-висока (Денехи R., 1990). Подобни данни бяха получени преди Vasilevym В. J. и сътр. (1989). Сравними съотношения индекси на чувствителност и специфичност ТЕМ и реакционната аглутинация латекс (62.5% и 75%, съответно) също бяха показани и Nozawa Santos N. S. (1989).

Последните изследвания са потвърдили тези констатации. Изследване на 103 деца методи ТЕМ EF PAGE и латекс аглутинация реакция (RLA) показва, че ротавирус се документират в 18% от деца. Освен чувствителност ТЕМ техники EF PAGE и RLA беше съответно 84%, 90% и 80%, специфичност като 100%, 100% и 81%, съответно (Хендрикс М. К. и др., 1995). В допълнение към диагностични цели, TEM се използва в научноизследователска и развойна дейност. По този начин, Zeng S. и др. (1994) се използва в изследване ТЕМ Rota-вирусен VP2 протеин.

Резултатите от директна електронна микроскопия картина на разширените функции и сглобяване структурен протеин VP2, както и образуването на вирусоподобни частици (HPV) и транспортирането на метаболити в вириона.

Особено големи усилия са направени в изследването на морфологията на ротавирус чрез модифициране на ТЕМ - krioe-електрони микроскопия което позволява изучаване роден небоядисани вирион 35А с резолюция, която позволява да се разкрие повърхностни структури на вируса и каналите проникващи вириона (Yeager М. и др ,. 1990- 1994, Estes М., 1996- Prasad V. и др., 1996).

По този начин, директно електронна микроскопия е ефективен диагностичен метод и оптимално refe-Лорънс-тест по време на разработването на нови диагностични методи с оглед на получените неоспорими резултатите, в резултат на редица изследователи смятат, електронна микроскопия "златен стандарт" (Bryden А. С., 1990). TEM е уникален в способността си да открива всички групи, различни от ротавируси и други чревни патогени: адено-, kalitsi-, астро и коронавирус, както и досега непознати инфекциозни агенти (Espinoza F. et AL, 1997).

Имуноелектронна микроскопия (ИЕМ) дава възможност не само за идентифициране на вируса в материал от пациента по морфологични неговите герои, но и за да се потвърди, че етиологията на болестта на определено ниво. Принципът на изследването е следната: имунен серум за ротавирус в разреждане 1: 5, се смесва с 0,4 мл 1% фекален суспензия избистря чрез центрофугиране. Сместа се инкубира 1 час при стайна температура, 12 часа при 4 ° С, след това се центрофугират за 90 минути при 15 000 об. / Мин за да се утаят вирусни частици и имунни комплекси. Nadosa-zling отдекантира и пелетата се ресуспендира в няколко капки дестилирана вода, оцветени (както е посочено по-горе), и се прилага към окото на пациент. Микроскопия се извършва с нарастващи лекарства 50,000.

В този случай Ротавирусните частици с характерна морфология и размер са идентифицирани в специфична формация имунен комплекс, който интензитет се оценява по броя на клъстери на мрежата и се изразява чрез произволна скала от 0 до 4+.

Чувствителността и специфичността на ЙОМ могат да се конкурират не само с ЕСС, но дори и с такъв общ метод като ELISA. По този начин, за типизиране на 24 щамове на ротавирус от ELISA и ЙОМ базирани на моноклонални антитела срещу VP7 беше установено, че ЙОМ в 2-16 пъти по-чувствителни от ELISA (Gerna G. и сътр., 1988).

В допълнение към стандартната техника на ЙОМ в работата на няколко автори проучен специфичността и чувствителността на няколко модификации на този метод: Филтриране комплекс агар имуносорбентен ЙОМ и makromarkirovaniya комплекс протеин А колоидно злато. Показано е, че всички модификации ЙОМ поне 20-30 пъти по-чувствителни от директни методи. Най-голямата чувствителност изпълнение се различава маркиран протеин А - колоидно злато, което е 1000 пъти по-чувствителни от директния метод на ЙОМ (Athanassions R. и др, 1994 Gonzalez S. А. и др, 1995).. Очевидно е, че по-нататъшно подобряване на IEM ще отвори нови възможности за този метод, но неговата висока чувствителност може да се постигне чрез внимателно стандартизация на реагенти, софтуер против ТРОЛ, както и високата квалификация на изследователя.

Обхват ИЕМ е богат: изследвания и развитие, клиничната практика, лабораторна диагностика, включително и пишете на ротавирусни щама препис от епидемии и др (Gerna Г. и др, 1988 Василиев BJ и др, 1989 Бейтс ... R. R. и сътр., 1993 Oishi J. и сътр., 1993 Zeng С. и др., 1994 Tokieda М. и др., 1996).

ЙОМ (като ТЕМ) също се използва като сравнителен тест за оценка на чувствителност и специфичност индекси на търговски диагностични китове (Ruggeri Е. и сътр., 1992). Примери, използвайки метод за декодиране ЙОМ в епидемиологични огнища могат да служат данни Oishi J. (1993). По този начин, когато се епидемия от гастроентерит при студенти в колеж в Япония TEM морфологични характеристики в изпражненията на пациентите са открити ротавируси. Освен това, тези материали имат отрицателно ELISA относително ротавирус група А. Приложение ЙОМ показа, че тези ротавируси са агентите на група С, която по-късно се потвърждава от PCR данни.

Обобщавайки резултатите от TEM и IEM, трябва да се отбележи, че тези методи имат първостепенно значение в началните етапи на диагностициране на ротавирусна инфекция. Въпреки това, в бъдеще, с развитието на методите за откриване на ротавирусен антиген-високо МКЕ IEM и чувствителност, простота и скорост на възможностите за скрининг на голям брой ниски разходи за материали, TEM и ИЕМ се дава достойна роля на референтните методи.

В същото време, ТЕМ и ЙОМ и са използвани досега в научните изследвания и клиничната практика, и двата метода за откриване на нови инфекциозни агенти не са известни.

метод имунофлуоресцентен (IPM), използвани в диагностични анализи за откриване на антиген в клетъчна култура заразен материал от пациента, в биопсия и аутопсия материал, и в kopromaterialah две модификации.

Принципът на директен метод IPM намалена до обекта за обработка (инфектирани клетки или тъканни срезове) специфични антитела, белязани с флуоресцентно багрило, които при контакт с антигена, осигуряват флуоресцентен микроскоп под влиянието на къса дължина на вълната луминисценция видима дължина на вълната (зелено или червено, в зависимост от вида на багрило) , В индиректен метод, обектът се подлага на два етапа IF обработка първо имунен серум с желания антиген и след това се маркира с флуорохром имуноглобулини, изолирани от серум на antispecies.

Методологията на IPM е изключително просто: намазки, инфектирани клетки, изяснени фекален суспензия са фиксирани върху предметни стъкла с ацетон при стайна температура в продължение на 10 минути. След това получаване се третира с флуоресцентен ротавирус серум докато контрастен фон албумин-родамин конюгат. След инкубиране при 37 ° С за 30 минути, излишъкът конюгат се промива с фосфатен буфер (рН 7,0), промива се, суши се и гледане под флуоресцентен микроскоп. Трябва да се отбележи, че като се kopromaterialov в първите часове на начало увеличава възможността за откриване на ротавирусен антиген. При провеждането на IPM необходимо да се включи контроли, които се използват предимно: лечение на специфичен конюгат на неинфектирани клетъчни-ТА, и - хетероложни конюгатни клетки, заразени с ротавирус. Най-често се използва в изследвания на IPM тъканни култури, заразени материали от човешки или животински пациент, което позволява бързо откриване virussoderzhaschie.kletki без да чака CPP (ISRC острови LA, 1988 Harsi C.et др., 1991 Tokieda М . и др., 1996). 46 (17.1%) - 40 така положителни проби (14.9%), в тест immunnofermentnom бяха идентифицирани в изследването в IPM и EF при пациенти с гастроентерит PAGE 268 деца под 1 година. Съвпадението на резултатите от тези методи се наблюдава при 72% от случаите (Harsi С. и др., 1991).

През последните години, етикет имунофлуоресцентно антитяло широко използвани за откриване на огнища (plyak) ротавирус в клетъчна култура, която значително подобрява чувствителността на този метод (Ис P.et др., 1994 Barnes G. и сътр., 1997). IPM се прилага и за откриване на ротавирус във външната среда (Strappe R., 1990).

По този начин, в момента имунофлуоресценция метод на научните изследвания в класическия вариант има ограничено приложение при диагностицирането на ротавирусен гастроентерит.

тестове Pretsipitatsionnye се основават на взаимодействието със серумни специфични вирусни антигени в агар под влиянието на осмотични процеси (RPG) или когато е подложен на статично електрическо поле - насрещно имуноелектрофореза (VIEF) (Galko NV и др, 1986 Zalesskikh А. Е. и сътр. ., 1990). Тези методи са били използвани в ранните етапи на изучаване на ротавирусна инфекция и сега почти не се прилага по отношение на развитието на по-добри тестове, с изключение на фин изследвания (Devitt С. и др., 1993). Въпреки това, pretsipitatsionnye Тестовете са подобрени чрез въвеждане в частиците на реакционната ротавирусни белязани с 32Р, което ще увеличи чувствителността както и специфичността на анализа (Tosser J. и сътр., 1994 Johansen К. и др през последните години., 1994 Ричардсън S . и др., 1993 Colomina J. и сътр., 1998), както и протеин на стафилококус ауреус (Colomina J. и сътр., 1998).

Свързан имуносорбентен анализ (ELISA) при диагностицирането на ротавирусен гастроентерит се използва най-широко. Броят на публикациите по този въпрос няколко стотин.

Принципът на метода ELISA свежда до факта, че носител на полимерен материал (микро панели ямки, мъниста, пръти и така нататък. D.) са покрити с антитела срещу ротавирус добавен тестов материал от пациент и се инкубира при 36 ° С Полученият комплекс AT-AG открива или антитела, белязани с ензими или серум първо се обработва с желания антиген и след това се използват добрите Антива-имуноглобулин белязано с ензим. Откриване на комплекс AT-AT + AH ензим или АТ-AH-АТ1-АТ2 + извършено чрез добавяне на ензим, субстрат за появата на продукт на цветна реакция. Разглеждане на резултатите от реакцията проведена като се използва ензимен имуноанализ анализатори. В допълнение към откриването на ротавирусен антиген ELISA може да извършва серотипа се изолира в материал от пациенти. За тази цел, методът за блокиране е предложен някои епитопи RV геном като се използва моноклонално антитяло тип или подгрупа специфичност (Green К. и др., 1990). Използването на моноклонални антитела VP7 и VP4 различни серотипове на човешки ротавируси позволява не само за въвеждане изолати, но също така насърчава изследването на епидемични процеси (Bishop R. и сътр., 1989 Gerna G. и сътр 1989 UnicombL. И сътр., 1993 Buesa G . и др., 1996- Gomez J. и сътр., 1990- Begue R. и др., 1992- Coulson BS, 1993 Woods P. и сътр., 1992- Nirdnoy W. и др., 1995- Wu Н . и др., 1998- Masen-dyzac P. и сътр., 1998).

Първите Елиза са били създадени като лабораторни тестове в края на 70-те години, и са разработени след това търговски продукти. Първият търговски циферблатът е Rotazyme (Abbot Laboratories Ltd), който се използва в химикалка система. Тогава Дако ООД създаде по-съвършен комплект - Бързо Elisa Дако ООД, а сега броят на търговските тестове, използвани в диагностичната практика, е изключително висока: Идея с ротавирус тест, Dakopatts, система за изпитване на СЗО, Testpack Ротавируси ротавирусът ОВОС, Pathfinder, Kallestadt | Rotaclone, ротавирус BIO - Bioenzabead Litton, Rotazyme II Abbott, Rotoscreen, Wellcozyme, Enzymgnost ротавирус, ротавирус имуноанализ, VIDAS ротавирус, NIV (Gowez J. и сътр, 1990- Begue R. и др, 1992- Rosmus К. и др .. ., 1992- Kelkar S., 1993 Unicomb L. и сътр., 1993 Sanchez R. и сътр., 1993 Broor S. и сътр. 1993 Денехи P. и сътр., 1994).