Вирусологични изследвания. Чревни заболявания. (Част 5)

Примери за използване на Western-блот за изследване на протеинова структура RRV-2, SA-11, DS-1 е работата Павлов и сътр. (1991). Прилагането на хиперимунен серум, авторите, извършвани от имуноблот анализ на VP1, VP2, VP4, VP7 - референтни щамове на ротавирусни маймуни и хора. По-късно, Zeng Р. и др. (1994), като се използва Western блот техника, последвано от използването на моноклонални антитела за имуноблотинг, VP2 изследва функции, SA-11, частиците монтаж механизъм VP2, VP2 / 6 и транспортиране на метаболити в ядрото.

Най-често срещаният метод на молекулна хибридизация е РНК-РНК хибридизация в Dot-блот и Northern-блот. Dot-блот (точка хибридизация) е най-лесно за един молекулна хибридизация, което позволява количествено определяне на вирусни нуклеинови киселини. Northern-блот - вариант молекулна хибридизация, при отделяне на нуклеинова киселина се екстрахира от електрофоретичен матрица, се прехвърля и имобилизиран върху повърхността на твърда фаза в същата последователност като те са в гела. В същото време, употребата на Dot-blot'e и Северна-blot'e сонди към специфични гени ротавируси, включително VP4 и VP7, дава възможност на изолати бяха въведени директно в материала на пациента.

Молекулно метод хибридизация се използва за диагностициране на ротавирусни инфекции (Novikova, А. и сътр., 1991, 1998- Krasko A. G. и сътр., 1991 Ginevskii VA и сътр., 1992- Фер-nandoz J. et др., 1992- Steele и сътр., 1996- Husain М. и др., 1996), но по-често за задачи, като например печатни изолат проучване атипични щамове междувидова и смесената група рекомбинация, по време на изследвания молекулни епидемиология, и междувидова и смесената група рекомбинация (Gorrell RY и сътр, 1996- Kuzuya М. и др, 1996- Nakagomi 0., Nakagomi Т., 1991 (а, с) - .. 1996- Ward R., 1990, 1991 Qian Y. и сътр., 1991 Palombo Е. и сътр., 1998).

Теоретичната възможността за прилагане на място на хибридизация за диагностициране на човека RV инфекция се демонстрира Krasko A. G. и сътр. (1991). Както са използвани проби 32Р-маркирани свински RV геномни сегменти транскрибирани ин витро чрез активиране на ендогенния РНК-зависимост Сима РНК полимераза, и транскриптите са получени за всички сегменти 11 RV.

Прилагането на този метод с помощта на сонда в РНК RV SA-11, също белязан с 32Р, оставя Novikova Н. А. и сътр. (1991) за откриване на RV РНК в назофарингеални натривки от 29 (76.3%) от 38 пациенти RVGE че потвърждава възможност RV геном транскрипция в клетките на лигавицата на носоглътката.

РНК-РНК диагностична стойност хибридизация се демонстрира Fernandoz J. и сътр. (1992) 303 в проби от изпражнения инспекция от пациенти RVGE чрез Dot-блот. Oligonukleo tidny-сонда, състояща се от 40 площ 33-72 VP7 гена нуклеотиди, най-много консервативни ротавируси. Като етикет използва биотин (биотин-дАТФ 7). Заедно с Dot-Петното се използва EF PAGE и ELISA. Там са били идентифицирани 230 положителни случаи, потвърдени от точка хибридизация и EF PAGE. ELISA се оказа по-малко надеждни, който разкри 7 фалшиви положителни и фалшивите отрицателни проби 12. Чувствителност на метода е 200 PG (Fernandoz J. и сътр., 1992). Резолюцията на Northern-блот е по-голяма и се оставя да се 6,0 PG откриване хомоложни РНК, където пробите не реагират дори с 100 нг на хетероложния РНК (Ali А. и сътр., 1993).

Използването на специфични проби на различни G- и P-тип отвори възможността да се получи ясна представа за ротавирус циркулационните в различни географски области (Sethabuthz О. и др., 1992- Husain М. и др., 1996- Correll RY и сътр., 1996- Ис P. и сътр., 1996- Ада М. и др., 1997).

РНК-РНК хибридизация е оставена да се документира присъствието на смесената група рекомбинация, което се случва ин виво, както и при отглеждането на ротавируси, принадлежащи към различни genogroups на клетъчна култура (Ward R., 1990- 1991).

Този метод също е в състояние по-точно характеризира членството на даден вирус в дадена група. Ротавирусната определена дивизия I и II подгрупи на настоящия етап не е напълно неверни, т.е.. Не всички изолати с. Fit "във вече добре познатите характеристики. Например, АС-1 щам не съответства на характеристика на подгрупа I, като въпреки това дълго foretipom. Само използването на данни хибридизация на РНК-РНК възможно да се идентифицира този щам и подобни тях изолати в отделна група (Nakagomi О., Nakagomi T. 1991 (а, Ь) - 1992). Освен това, РНК-РНК хибридизация класифицира ротавируси на генетично ниво (т.е.. Н. Genogrouping), което е особено ценно за изследване на атипични ротавирусни щамове (Nakagomi G., 1996).

В допълнение към РНК-РНК хибридизация показва използването на РНК-ДНК хибридизация (Southern блот). комплементарна ДНК (ДНК) се получават тази цел чрез обратна транскрипция на геномна РНК в различни сегменти. Доказано е, че най-ефективният хибридизацията се наблюдава, когато се използва като сДНК проба за сегмент 3 RV геном. Както етикетите, използвани с 32Р. Ефикасността на Dot-блот хибридизация на РНК-ДНК е 0.5 нг. В този специални изследвания е показано, че сДНК сонди, използвани не дават кръстосана реакция с други групи RV РНК (Eiden J. и сътр., 1989).

Трябва да се отбележи, че стопанство място РНК-ДНК хибридизация за диференциацията на серотиповете в присъствието на 50% формамид с прави реакцията строго специфични (Rosen V. и др., 1990). Освен това, провеждането на реакцията на хибридизиране е възможно не само да се олигонуклеотиди, белязани с 32Р, но също така и на алкалната фосфатаза (ALP). Освен това, използването на два маркера в проучването на 148 проби от РНК-ДНК хибридизация показват подобни резултати (Sethabutr О. и др., 1992).

Southern блот се използва широко в откриването на ротавирус геном и околната среда. Използване на РНК-ДНК хибридизация RV се открива в питейната вода, почва, отпадъчни води (Ginevskii VA и сътр., 1992- Zothikumae Н. и др., 1995- Grinde V. и др., 1995- Dubois E . и др., 1997).

По този начин, методи на хибридизация се характеризират несравнимо по-висока чувствителност и специфичност от лабораторни тестове и могат да бъдат успешно използвани като отправна точка за оценка. Те са универсален метод за диагностика и типизиране на ротавирус и позволява да пишете на изолати на себе си материал от пациенти.

През последните години, въз основа на последните биотехнологиите и генното инженерство са разработили уникален метод за диагностика на вирусни инфекциозни заболявания, използвайки полимеразна верижна реакция (PCR). За разлика от традиционните техники ELISA накапването хибридизация, като се гарантира надеждно откриване на 0.1-10 милиона целеви молекули (антигени или нуклеинови киселини), PCR метод позволява да се определи само една молекула нуклеинова киселина в пробата.

PCR се базира на две основни свойства на нуклеинова киселина - за разделяне синтезирани двойни вериги на геномна ДНК и повторно синтезиране на базата на тези комплементарни нуклеинови структури.

За реакцията на пробата за изпитване с протеиназа К и фенол-хлороформ изолирана нуклеинова киселина (Oischi J. и сътр., 1993 Gouvea V. и др., 1991). Във връзка с необходимостта от използване на токсични вещества, като например фенол, хлороформ, хлорофлуоровъглерод, друг метод е разработен двойноверижна РНК изолация и пречистване на базата на използване на гуанидин, и gidrooksiapatita tsetiltri метил-амониев бромид (Santos Н., Gouvea V., 1994) , Методът е прост, ефективен, позволява да се освободи РНК от ензимни инхибитори, и дава по-висок добив на вирусна РНК. Денатурира чрез отгряване (90 ° С) нуклеиновите киселини се поставят в среда, допълнена с праймери нуклеинова киселина и термостабилна ДНК полимераза. При 36 "С в отделна нишка ДНК с ДНК полимераза синтезира комплементарна структура. Праймерите определят коя част от РНК се възпроизвежда, и прибавяне на стоп кодони води до факта, че полимеризацията не е по цялата дължина на ДНК верига, и само една част от веригата, отговорни за определени функции геном, т. Е. Gruppo-, типа или serospetsificheskie геном последователност. След това температурата се повишава до 58-60 ° С, при което се синтезират разкъсвания на двойната верига. След това температурата се понижава до 36 ° С, и синтез на комплементарни вериги се повтаря в две секции вече вериги и т. Г. В резултат на често повтаряне на тази процедура, броят на строго специфичен за всеки патогени нуклеотидни последователности се увеличава с няколко порядъка. Теоретично чувствителността на просто отстранява, като в този случай на една верига да получите 1000-кратно натрупване на нуклеотидни последователности. Този метод не изисква радиоизотопи беше един милион пъти по-чувствителни от стандартния метод използване elektroforeti-превръзка ДРНК - геномни сегменти и 5000 пъти по-чувствителна техника на молекулна хибридизация (Xu L. и др, 1990) .. Според Eiden J. и сътр. (1991) PCR чувствителност в рутинни изследвания подходи femtokolichestvam (80 еж).

Трябва да се отбележи, че като изходен молекула за PCR може да се използва ДНК или сДНК получена от РНК чрез обратна предварителна обработка traskrip-tazoy последвано от амплификация. РНК се възстанови от двете прясно приготвени клетки, тъкани и замразени, liofi-лизиране агенти или фиксирани, т.е.. Е. предмети преди недостъпни за анализ. Този вид е известен като PCR revertaznoy обратно transkriptatsionnoy полимеразна верижна реакция (RT-PCR). Същността на тази модификация е да се използва PCR oligonukleotnyh двойка праймери, способни специфично да хибридизират до нуклеотидните последователности в противоположните краища на вериги част на две ДНК. Като праймери за едновременно синтезиращи комплементарни вериги с помощта на термостабилна ДНК полимераза. Повтарящи се цикли на денатурация на двойната спирала на ДНК нишки след приключване на отгряване с праймери водят до експоненциално нарастване на броя на ДНК фрагменти, фланкирани от нуклеотидни последователности, съответстващи на първичната структура на праймерите. В резултат на това количеството на 30-40 цикъла на амплификация реакция на ДНК молекули в пробата се увеличава в 108-108 пъти, което позволява да се определи TsPDvo 104 / мл, и не дава кръстосани реакции с други вируси (Kweon S. Н. и др., 1997). В същото време, нито един от RV праймерни двойки не реагира в RT-PCR с фекални проби, съдържащи ротавируси от друга група, както и проби от контролните не-заразени хора и животни, което показва висока специфичност на метода (Eiden J. и сътр., 1991).

Последователностите на амплификация може да бъде видян в UV светлина на продуктите PCR след фракциониране чрез гел електрофореза в присъствието на етидиев бромид (Gouvea V. и др., 1991 Oishi I. и др., 1993). Полученото количество от ДНК фрагменти е достатъчно за анализ с други молекулни биологични методи: Dot-блот хибридизация, секвениране, клониране и други.

Понастоящем изпълнява праймери подбор за откриване на ротавирус група А, Б и В гени, 9, 8 и 6, съответно (Gouvea V. и др., 1991 Oishi I. и др., 1993 Buesa I. и др., 1996 ). Методът на RT-PCR се използва за определяне ротавируси дори в случаи, когато други методи не позволяват да се идентифицират (Ushijima Н. и др., 1992- Oishi I. и др., 1993 Jiang Б. и др., 1995). През последните няколко години, ние представяме данни за използването на PCR за G- и R-серотип RV. Авторите показват, че най-често при хора ротавируси, принадлежащи към видове G1-G4 и Р4, Р6, Р8 и Р10 (Taniguchi К. и др., 1992- Correll RJ, Palombo EA, 1996- Husain М. и др., 1996- Espinoza Е. и сътр., 1997). Тези данни позволяват да се получат бързо подробна информация за молекулната основа на епидемиологични варианти на ротавирус, който е изключително важен в епидемиологията и в строителството на ротавирусни ваксини (Richardson S. и сътр., 1998- Leite I. и др., 1996- Arista S. et др., 1997 Ада М. и др., 1997).

Въпреки големия брой проучвания потвърждават високо специфичност и чувствителност на PCR, редица автори провежда сравнителен тест на този метод с традиционните диагностични методи: ELISA, EF СТР, ТЕМ. PCR-висока чувствителност в сравнение с ELISA демонстрира Wilde J. 103 стол проба се получава 40 Разглеждането на деца. В PCR открити 60 положителни случая (53%) в сравнение с 37 (36%) в IFA. Освен това, средната продължителност на вирусната екскреция е равна на 9.5 дни за данни PCR, в сравнение с 5.6 дни в IFA (Wilde J. и сътр., 1991). Подобни резултати, което показва висока чувствителност на PCR в сравнение с ELISA, получени идентификация Tani-guchi К. 115 kopromaterialov от болни деца изобретателите, че диагнозата се потвърждава от PCR с 93% в сравнение с 82,6 чрез ELISA. (Taniguchi К. и др., 1992).

Последната работа е напълно потвърди тези резултати. По този начин, чрез сравняване на PCR PAGE и ELISA се използва за откриване на ротавируси в материали болни деца, процентът на положителните резултати е: 94, 91 и 80%, съответно (Husain М. и др, 1995). Подобни резултати са получени по време на разглеждането на 220 пациенти ИКП ООД. Процент на откриване ротавирус при индивиди материали изследвани с PCR, ELISA, SDS и ТЕМ, съответно от 30, 29, 26,8 и 25,4 (Buesa J. и сътр., 1996). . Според Masendyacz R. и др, чувствителност и специфичност, методи за откриване на три RV kopromaterialyah диария пациенти са: PCR - 92 и 98% - РНК-ДНК хибридизация - 80 и 99% - IFA - 73 и 81% (Masendyacz R. и сътр., 1998).

Както се вижда от докладваните данни, анализ на ротавирусна РНК са все по-често се прилага на практика, въпреки известна сложност и високата цена на научните изследвания, и се използва както за диагностика и за характеризиране на патогена. Този процес е интензивно с развитието на PCR, най-чувствителен и специфичен диагностичен техника, която по мнението на много автори, в момента е "златен стандарт", което по-рано е ТЕМ (Nakagomi О. и др., 1994 Masendyacz R. и др ., 1998).

По този начин, PCR е молекулярен биологичен тест на новото поколение, което отваря големи възможности в класификацията, писането, обща и молекулярна епидемиология за ротавирус. Все пак трябва да се отбележи, че PCR изисква висококвалифицирани изследователи, скъпи реактиви и относително сложно оборудване. В същото време, по-нататъшно усъвършенстване на метода, очевидно е, да се направи PCR по-достъпни за широк спектър от диагностични лаборатории.

Обобщавайки използването на методи за идентификация на ротавирусна в различни изследователски съоръжения, следва да се отбележи, че на практика всички от обсъжда в този метод материалът има както предимства, така и недостатъци, изразени в различна степен. Получаване на скоростта на реакция, способността за изследване на голям брой проби едновременно, метода на сложност и необходимостта от използване на скъпо оборудване и reagentiki, чувствителност и специфичност на метода и в крайна сметка, разходите за анализ на всеки един от тези методи се различават значително. Следователно - изборът на подходящ метод за всеки отделен случай е индивидуален и не е лесна задача, поради големия брой тестове, различни възможности диагностична лаборатория и предизвикателствата пред тях.