Вирусологични изследвания. Чревни заболявания. (Част 1)

Изолиране на вируса. Откриване на вирусен агент - възбудител патологично състояние е основен триада Koch доказателства за причинно-следствената връзка инфекция. В тази връзка, за изолиране на вируса е изключително важно и е основна брънка във веригата от събития, за лабораторна диагностика на ротавирусна инфекция. Освен проливането остава един от малкото практики, които могат да бъдат последвани от откриването на нови вирусни агенти, агенти на неизвестното сега вирусни заболявания. Ето защо, за изолиране на вируса в различни биологични модели (в повечето случаи - културалните клетки) са много широко практикуван. Понастоящем като биологичен модел най-често се използват редица клетъчни култури: МА 104, 4647, GBK, НТ-29, CV1, Vero, Сасо-2 и т.н. (Ramishvili L. G. и др, 1991 J. Hapchaev .. X. и сътр., 1989 Кларк Н. и др., 1988 Konno Т. и сътр., 1993 Ward R. и др., 1990- Bernstein D. и др., 1989 Sato K. и др. , 1995- Weber Б. и др., 1992- Марковска-Daniel J. и сътр., 1996- Shinozaki К. и др., 1996- Superti Е. и сътр., 1997).

Изолиране на вируса в клетъчни култури се извършва в 2 етапа: вирусна инфекция на клетъчни култури (I) и неговото възпроизвеждане на документиране на вид СРЕ или ELISA, IPM, страница, PCR метод plyakoobrazovaniya ТЕМ и (II). Поради особената важност на този метод ние се някои подробности позволи. Изпражненията проби, взети през първите 2-3 дни на заболяване в стерилни съдове и транспортирани в съд с лед или друг охладител. Материалът на тест, за да се третира веднага след доставяне на лабораторията или съхранява при минусови температури. Преди изходни вирусологични проби се размразяват, взети 0,5-1 г изпражнения и растежна среда се прибавя (Eagle, Ърл, Henke) в количество, необходимо за получаване на 10% суспензия. gomogeneziruyut суспензията повтаря докато еднакво енергично разклащане (с или без зърна), или чрез замразяване и размразяване. Хомогенизиране на суспензията е по-леко разклащане, т. К. Virusosoderzhaschego замразяване и размразяване на материала води до деградация VP7 (Nirdnoy W. и др., 1995). Суспензията се центрофугира в продължение на 10-15 минути при 1000-2000 г, освободени от утайката и супернатантата се излива но 1 мл за вирусологични изследвания или се съхраняват при -20-70 ° С, в зависимост от периода на съхранение. След това вирусът се активира в продължение на 30 минути при 37 ° С с трипсин при концентрация от 10 мкг / мл и се центрофугира в продължение на 2 минути при 15000 грама. След четири дни монослой се промива два пъти с DMEM и зарази 1-2 LG (10-30 вирусни частици за клетка) върху активен RV среда (DMEM, MEM Eagle с Hanks), съдържаща 10% фетален телешки серум и антибиотици. Според различни автори, ние използваме 100-500. пеницилин, 100-500 мг стрептомицин, 40 мг гентамицин и 50 единици. нистатин в 1 мл. След 2 часа адсорбция при 37 ° С, клетките се промиват и се зареждат с DMEM съдържащи антибиотици и 4-13 мкг / мл трипсин (Clark Н. и др., 1988 Sato K. и др., 1995).

Положителният ефект на трипсин показа ротавирусни процеси репликация и Т. Konno и сътр. (1993). Авторите потвърдиха, че трипсин активира производството на вирус чрез селективно засяга функцията на VP4 и външен капсид протеин, дезинтегриращи тях. Това води, от една страна, да се намали GEMAG-glyutiniruyuschey вирус активност, и от друга - да се подобри проникването на вируса в клетката, която е да се третира с трипсин вириони влизат в клетката и възпроизвеждат, и сурова - .. подлагат на ендоцитоза, и не се повтарят. По този начин, прилагането на трипсин в доза от 0.1 до 10 мг / мл резултати в увеличен инфекциозността на вируса. инфектирани клетъчни култури бяха наблюдавани в продължение на 5-7 дни. Появата на СРЕ показва наличието на вируса, който след това е документирано ТЕМ EF PAGE използване на антисерум или - ЙОМ и IFM Ал.

Ако не СРЕ се замразяват култура и да допълнителни пасажи в същите условия, с изключение, че вирусът се активира чрез третиране с трипсин 4 мкг / мл при стайна температура в продължение на 2 часа.

Тъй пасаж 4, CPE обикновено открит след 4-5 дни след заразяването (Ward R. и др., 1990- Bernstein D. и др., 1989).

Въпреки това, поради ниската чувствителност към клетъчни култури природен изолати рутинен диагностичен метод ротавирусен гастроентерит при отделяне не. Тъй неадаптирани за изолиране на клетки могат да се размножават в тях, без откриване СРЕ на вирус от допълнителни методологични техники значително повишава ефективността на метода. Това се потвърждава от проучване, проведено от W. Weber и сътр. (1992). Авторите, заедно с откриването на ротавирусна CPD провеждат сравнително изследване на няколко метода за откриване на ротавирусен в заразените клетки чрез изследване на проби от изпражненията 121 от децата с гастроентерит преди навършване на 3 години. Стандартна избор в МА-104 клетки под контрола CPP показа 3.3% на положителни резултати, докато използването на маркери имунопероксидазно диагностичен ниво повишава до 40,5%, и използването на IFA и EF PAGE - до 54.4% и 46.3 %, съответно.

Тъй HRV не винаги предизвика СРЕ и реплицира в конвенционалните клетъчни култури, Genthe V. и др. (199TS след 18 часа на културата в МА-104 открива чрез вирусен вътреклетъчен антиген ELISA, използвайки антисеруми, пероксидаза белязано. Сравнение tsitoimmunnoy техниката белязани антитела с търговски за определяне на тестови системи, ELISA и латекс аглутинация показват, че tsitoimmunny Метод 10 пъти по-чувствителни.

Подобни резултати са получени през последните години. Така съгласно Markowska-Daniel J. и сътр., ELISA ротавирус в изпражненията е намерена в 32% от случаите. Прилагане на МА-104 култура и възпроизвеждане документ IPM вирус, ТЕМ и EF PAGE клетки се увеличава процентът на откриване на вируса на 64,0% (Markowska-Daniel J. и сътр., 1996).

Класическият субстрат за възпроизвеждане на ротавируси е бъбречна клетъчна линия МА-104 маймуна, която се използва най-често, не само за диагностика, но също така и за изследователски цели (Johansen К. и др., 1997 Kobayashi Н. и др., 1995) и също във ветеринарната практика (Gulati V. и др., 1997). Показано е, че МА-104 поддържа не само възпроизвеждащи ротавирус от група А и С, но при условие, при висока концентрация на трипсин културалната среда съдържание (Tsunemitsu Н. и др., 1991). Въпреки това, поради недостатъчната чувствителност на клетките към ротавирус се провежда като търсенето на други линии, клетки и методи, подходящи за изолиране и размножаване на ротавирус, и разработването на методи за повишаване на чувствителността на клетките към ротавирус. Установено е, че клетъчна линия човешки карцином на дебелото черво НТ-29 е по-чувствителен от УО-104 в разпределението на човешки ротавирус. В контраст, МА-104 НТ-29 ротавирус растеж открива в първата или последващи пасажи, дори ако процентът на инфектираните клетки е нисък (Superti F и сътр., 1991, 1997).

Друга линия на карцином на дебелото черво Сасо-2 клетки се използва също да се подчертае RV. Използването на тази клетъчна линия в присъствието на трипсин (4 мкг / мл) се изолира Група С RV в Япония, които се използват без CPP и е документирано ТЕМ ЙОМ и IFM обратна връзка TPHA (Shinozaki К. и др., 1996).

Клетки от бъбрек на линия говеда, GBK също дават по-високи резултати при титруване на ротавируси, изолирани от телета (1-2 LG при по-висока от МА-104 клетки). Трябва да се отбележи обаче, че клетки, предварително третирани с dietilaminoetildekstranom доза мкг / мл и поддръжка среда се прибавят 50 в kontsentartsii трипсин 5 грама / мл (Konno Т. и сътр., 1993).

Повишаване на чувствителността на клетките към вируси като цяло, и по-специално ротавируси постига чрез използване за тази цел на химични и физични методи. Показано е, че центрофугирането, постоянната люлее или внезапно термичен ефект (топлинен шок) насърчаване на растежа на броя на увредените клетки, повишаване на добива на вируса или повишаване на нивото на вирусното отделяне в диагностични изследвания вирусологията. От химични методи на влияние трябва да се отбележи ефективност на диметилсулфоксид, което подобрява процеса на трансформация на клетки, инфектирани с вирус, plyak увеличава броя и размера увеличава добива на вирус (Hyghes J. Н., 1993). В разредител идентифицирането на вируса може да бъде постигнато с помощта на плаки, образувани под влиянието си в тъканна култура. Метод за получаване на плаки разработен Dulbecco R. (1952) в различни варианти и е широко използван в настоящото. Принципът на метода е, че разреждане на вирусна суспензия се прилага към монослой на тъканни култури в петриеви блюда ploskostennyh флакони, кладенци пластмасови плочи. След вирус адсорбция към клетките, покрити със слой от хранителен агар. Поради Агар капак, възпроизвеждане и разпространение на вируса е ограничена до само първоначално заразен и в съседните им клетки. Така оформен органичен клетъчна дегенерация огнища - така наречените "плаки" (plyaki). Обикновено те са идентифицирани чрез оцветяване със слой боя интравитална клетки - неутрално червено, което е било включено в състава на покритието агар, или приложена върху него непосредствено преди въз основа на резултатите. Плаките не адсорбират багрило и следователно да бъдат под формата на светли петна на фона на оцветяват живите клетки (Tosser J. и сътр., 1994).

За откриване на плаки с изключение на неутрално червено могат да се използват и други багрила като кристал виолет. Един инфекциозна вирусна частица представлява единична плака, която позволява да се прилагат blyash-koobrazovanie като точен метод за количествено изследване на вирусна инфекциозност и измерване неутрализация активност антитяло. Използването на плаката може да изчисти вируса, т.е.. Д. Получаване на своите изчистени линии (Ис Р., Снодграс Г. 1994- Уорд Р. и др., 1998). При извършване на такива почистване слой клетки след адсорбция на вируса необходимо да се измие щателно вирусните частици от адсорбирания и само след това се прилага агар покритие. Трябва да се отбележи, че използването на диметилсулфоксид, dietilaminoetildenetrana (DEAE), трипсин има стимулиращ ефект върху образуване на плака (и понижаване на концентрацията агар в покритието).

Shgapo Н. и др. (1987), използван метод за получаване на плаки за откриване на Раман ротавирус при новородени телета, сравняващи две линия клетъчна култура МА-104 и GBK (RNC бъбречни клетки). Потвърждаване на използването на МА-104 клетки, те предложено да се използва за тази цел линия GBK клетки и разработени модификация на плаката. пластмаса петриева паничка с диаметър 6 см сял 0.8-1.0 х 106 клетки в 5 мл растежна среда. След 2-3 дни след образуването на монослойни клетки се промиват и се прибавят 2 мл 0 ротавирусен щам (Lincoln) се разреждат в културална среда с 50 мкг / мл DEAE. След 90 минути инкубиране при 37 ° С се наслоява 5 мл културална среда с 0.8% агар, 10% Tryptose фосфат бульон, 5 г / мл трипсин и 50 мкг / мл DEAE. След 3 дни, вторият пласт покритие, съдържащ неутрален червен при крайно разреждане от 1: 5000. След 6-8 часа се преброяват chisyo плаки.

Друга модификация получи плаки използвани Bernstein D. и др. (1989) в изучаване на отделяне на ваксиналния щам при възрастни доброволци, ваксинирани с ваксина ротавирус тоалетната на 3. За тази цел, 1 мл от предварително обработени, както е описано по-горе, проби от изпражнения бяха инкубирани за 30 минути при 37 ° С с 10 мкг от трипсин и се поставят върху монослой ма- 104, промива се двукратно с балансиран солев разтвор на Ърл. След адсорбция 1 часа монослой при 37 ° С и се промива отново излива DMEM среда с антибиотици, 4 микрограма / мл трипсин, 25 мкг / мл DEAE и 0.2% агароза и се инкубират в продължение на 4 дни при 37 ° С второ покритие наслоява агар След отстраняване на средата с кристално виолетово за визуализация plyak.

Понастоящем визуализация plyak постига чрез имунофлуоресцентно оцветяване или радиоактивен етикет, като метод, който повишава чувствителността и специфичността (Ис R. и сътр., 1994).

По този начин, проливането остава важен метод за потвърждение на етиологията на заболяването, но сега благодарение на възможността за използване на широка гама от съвременни диагностични методи за нейното прилагане, като рутинен диагностичен тест изглежда непрактично.

Електронна микроскопия RV. Virus откриване чрез електронна микроскопия се провежда в две модификации: директна електронна микроскопия (ТЕМ) и immunnoelektronnaya микроскопия (ЙОМ).

Известно е, че в началото на съдържанието на ротавирус болестни kopromaterialah достига такива количества, които позволяват откриване си чрез електронен микроскоп в D-20% суспензия без допълнително концентрация. След това суспензията се избистря чрез центрофугиране няколко капки разтвори супернатантни контрастира фосфоволфрамова киселина (2.1%) уранил ацетат (0.25-1%) или амониев молибдат (1%) и се прилага към електронен микроскоп решетки субект. Drug проучване, проведено в електронен микроскоп с увеличение от 50 разкри 000 принадлежност към ротавирусни частици се определя от характерната морфология.

Метод за директно електронна микроскопия (ТЕМ) в различни модификации се използва за диагностични и изследователски доста широко (Vasil'yev В. J. и сътр., 1989, 1995, 1996- Zarubinsky В. J. и сътр., 1989 KHAUSTOV VI "и др. 1989 Shelkovskaya Н. G. и сътр., 1991 Денехи R. и др., 1990- Donneli G. и сътр., 1993 Zeng С. и др., 1994 Oishi J. и сътр. , 1993 Gonzalez S. и сътр., 1995- Хендрикс МК и др., 1995- Jiang Б. и др., 1995- Buesa J. и сътр., 1996- Tinari А. и сътр., 1996- Andrade GP et др., 1997 Superti Е. и сътр., 1998).